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精彩回顾 | 微生物病原体检测方法简介

2020/6/14 16:18:11      点击:

在中国科协信息中心的指导下,中国知网与《中国科学:生命科学》、《中国生物工程杂志》、中国生物工程学会科普工作委员会联合组织生命科学前沿热点公益讲座活动2020520日,武汉大学药学院刘天罡教授受邀网上进行生命科学前沿热点公益讲座第八讲,以下是对刘教授的授课内容进行的重点内容整理。

首先,刘教授指出目前感染性疾病即人体因受到病原菌侵袭而发生的疾病是人类的一大杀手,心脑血管疾病、糖尿病、肿瘤癌症等疾病治疗过程中的继发感染是造成人类大量死亡的因素之一。感染性疾病种类按病原体可分为病毒、细菌、真菌和寄生虫引发的疾病。目前席卷全球的新冠病毒就属于病毒类感染性疾病。

一、临床病原菌感染治疗现状

对于细菌、真菌感染治疗,主要是根据病原菌种类使用抗生素治疗,武器库庞大,但难点在于如何快速找到合适的治疗方案。同时由于病原菌构成复杂,病原菌不明和经验性用药导致目前细菌耐药严重,科学家推测2050年每年将有超过1000万人死于细菌耐药性感染。


对于病毒感染的治疗情况则更为严峻。病毒诊断较为困难,诊断时间较长,而呼吸道等病毒传播速度快常导致患者无法得到及时治疗。且目前病毒感染主要靠疫苗防治,没有特效药进行治疗。


刘教授指出目前感染性疾病的重难点在于病原菌的诊断,迫切需要快速、全面、准确的病原菌诊断手段。

二、传统病原学检测方法

通过对人的痰液、血液等分泌物用特定的培养基进行培养,使微生物长成肉眼可见的状态,利用经验判断病原菌种类。这种方法的优点在于富集得到的病原体可以用于药理测试和感染机理的研究,是病原体检测的金标准。它的缺点在于耗时长,细菌培养一般需要1-3天,真菌养一般需要1-3周,对于发病较快结核杆菌等则需要1个月,同时还存在漏检漏筛等问题。因此从临床经验上来看对于急性感染疾病一般无法用这种方法在就诊前获得检测结果。目前传统检测方法结合了MALDI-TOF-MS技术后检测速度加快,但也局限于数据库内微生物的检测。


三、 致病菌和病毒检测新方法

目前主要有三种方法,分子诊断技术、免疫学检测方法和化学法检测,包括了CaT-Smelor和生物传感器。目前使用最多的是分子诊断技术,其余新兴的诊断技术还未在临床中投入使用。

1. 免疫学检测方法

利用抗体对抗原的特异性识别进行检测。刘教授以新冠病毒为例解释检测指标,即感染病毒后经过孵育期病毒大量繁殖,后人体开始发烧产生第一代抗体IgM,大约七天后产生记忆性抗体IgG。新冠病毒检测中IgM阳性表示身体还未产生记忆性的抗体,检测到IgM表示病毒还未被清除完全,IgG阳性表示人体产生记忆性的抗体并将保持较长的时间。


临床上常使用Elisa检测方法,以新冠病毒为例,将抗原新冠病毒的N蛋白制备后固定在基质上,血液中的抗体与N蛋白结合,另加能够与血液中抗体结合的抗体和酶复合物,利用酶与加入底物反应产生显色信号进行检测。


2. 分子诊断技术

分子诊断技术包括了杂交、PCR技术、恒温扩增、CRISPR和高通量测序。前四种方法都是利用对致病菌特异序列的互补识别进而进行检测。目前所说的核酸检测就是使用了PCR技术,利用高温将DNA双链打开,利用特异性引物扩增目的片段进行检测。临床上使用的多是由PCR衍生出TaqMan探针的qPCR技术。它的原理是荧光基团与猝灭基团相连时不产生荧光信号,当探针与靶DNA结合时,Taq5’3’活性将荧光基团切除,解离出的荧光基团与猝灭基团分离发生荧光信号,由此进行检测。


近年来发展出了重组聚合酶扩增反应技术(RPA),利用加入单链结合蛋白使DNA双链打开,将重组酶和引物结合对特异片段扩增,由此实现在37℃等温完成反应,使检测过程不需要使用昂贵仪器,在家中就可完成,并且减少了调节温度的过程大大缩短了检测时间。目前操作的问题主要在于重组酶比例的调节。


CRISPR基因编辑技术时近年来的热门技术。目前临床诊断上开发识别靶标核酸的gRNACAS蛋白结合的复合物,其与核酸结合后形成具有切割功能的的复合物,使用与TaqMan探针类似的方法利用荧光基团和猝灭基团的相互反应通过检测应该信号进行诊断。目前的研究主要围绕在利用不同功能的CAS蛋白设计检测方法。


3. 基因测序技术

对于前面针对少数特异片段的检测技术,刘教授将其称作狙击枪,而对于目前主流的针对大量密集片段检测的基因测序技术,刘教授将其称作霰弹枪或是榴弹炮

目前基因测序大致可分为三代测序。一代测序用双脱氧核苷酸作为链终止试剂得到无数基因片段,通过对基因片段拼接得到完整的序列。目前一代测序检测准确度仍是最高的,是检测金标准

二代测序也叫高通量测序,它将PCR过程与测序过程结合起来,利用磁珠或芯片,一边进行PCR扩增一边检测荧光信号,并同时检测大量片段,大大提高了通量。临床上将样品的基因的所有位点进行无差别检测,后去除人类基因组部分,得到病原体的信息,通过数据比对进行解析。


三代测序则是单分子测序。其中代表性的的Nanopore技术是利用生物膜的孔道蛋白使只允许单链DNA通过,两端加以电压,通过电位差变化实时检测序列。刘教授实验室使用的测序方法NTSNanopore Targeted Sequencing)则是利用了Nanopore技术,特定地富集细菌的16S和真菌的ITS来开发了针对细菌和真菌的检测方法,达到接收样本开始 24h内可同时鉴定真菌和细菌感染,最快可6h得到细菌鉴定结果。这是目前世界上最快的以测序的方式反馈检测结果的方式。


本次的新冠疫情中,刘教授团队根据掌握的纳米孔检测技术迅速开发了针对新冠病毒的检测技术,将新冠病毒的核心区域通过PCR扩增后一起进行上机检测。这个技术灵敏度高,可检测10大类40余种呼吸道病毒,还可检测病毒突变对病毒进行分型,对诊断后针对性治疗具有重要意义。刘教授团队研发出的检测方法也被人民日报、国务院联防控、焦点访谈等报道并推荐用于临床。



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